2. LE BASI CROMOSOMICHE DELLA SINDROME DI DOWN VALTER GUALANDRI La sindrome di Down (SD), intesa nei suoi aspetti clinici, morfologici ed evolutivi, è determinata da un eccesso di DNA nella dotazione genetica individuale. Normalmente nella cellula in fase di moltiplicazione per mitosi il DNA si organizza in strutture “bastoncellari” dette cromosomi, che nel corredo cromosomico sono ordinate in 23 coppie (22 coppie di autosomi ed una coppia di cromosomi che determinano il sesso o eterosomi). Nella SD risulta coinvolto il cromosoma 21 che può assumere diversi assetti, caratterizzati comunque dalla presenza di un cromosoma 21 soprannumerario. Precisamente i quadri cromosomici, che risultano dall’esame cariotipico, o mappa cromosomica, possono presentare le seguenti caratterizzazioni: a) trisomia libera: è presente un cromosoma 21 soprannumerario rispetto alla normale dotazione individuale di due cromosomi 21 (uno di origine materna ed uno di origine paterna). Il valore genomico, ossia il numero totale di cromosomi, corrisponde a 47 e si usa esprimere il cariotipo di una persona Down con trisomia libera come: 47, XX, +21 per una femmina, 47, XY, +21 per un maschio. La trisomia si realizza al momento della fecondazione quando uno dei gameti che vi partecipa, principalmente la cellula-uovo, porta due cromosomi 21 invece che uno solo, come vorrebbe la maturazione germinale. La maturazione germinale o “meiosi” implica normalmente la riduzione a metà del numero dei cromosomi, nel senso che nei gameti maturi è presente un solo cromosoma per ogni coppia di cromosomi della dotazione individuale: dunque 23 cromosomi. Tab. 1. Correlazione tra età materna e rischio di concepimento di un feto Down (da Geleherter T.D., Collins S.C., Ginsburg D., Genetica medica, Masson Ed. 1999). A seguito dell’unione di uno spermatozoo con una cellula uovo (fecondazione) si ristabilisce il corredo cromosomico normale: 23+23=46. In sostanza, nella SD si verifica un errore nella meiosi femminile o raramente maschile. Non esistono dati somatici o di qualsivoglia natura associati all’errore meiotico, salvo una correlazione, valida a livello statistico, fra l’età della madre ed il rischio di concepire un feto Down (Tab. 1). La trisomia libera è il più frequente reperto citogenetico nella SD (circa 80 volte su cento) Fig.1. b) trisomia da traslocazione: il terzo cromosoma 21 è traslocato, ovvero unito a livello dei centromeri, ad un cromosoma del gruppo D (cromosomi 13, 14, 15) oppure ad un cromosoma del gruppo G (cromosomi 21 e 22). Questa situazione è presente nel 20% circa dei casi di SD. Il cariotipo di una persona Down con traslocazione si esprimerà dunque: 46, XX, der (15;21) (q 10;q 10) per una femmina; 46, XY, der (15;21) (q 10;q 10) per un maschio. Al posto del “15” che indica il cromosoma sul quale trasloca il terzo 21, possono essere citati anche i cromosomi 13 e 14 (gruppo D del cariotipo) oppure 21 e 22 (gruppo G del cariotipo). La traslocazione del cromosoma 21 soprannumerario su un altro cromosoma del gruppo D o G può essere del tutto casuale nello zigote concepito (l’80% dei casi di traslocazione), oppure può derivare da una condizione già presente in uno dei due genitori. Il genitore è portatore di una traslocazione del cromosoma 21 su D o G ma ha un solo cromosoma 21 libero e pertanto il cariotipo non manifesta squilibri quantitativi del materiale ereditario: si parla in questo caso di cariotipo bilanciato. Un cariotipo bilanciato potrebbe per esempio essere: 45, XY, der (15; 21) (q10; q10) nel maschio o 45, XX, der (21; 21) (q10; q10) nella femmina. Questa dizione indica che la femmina che ha questo cariotipo possiede come di norma due cromosomi 21 sovrapposti l’uno sull’altro, ma non ha altri cromosomi 21 tanto che il numero totale dei cromosomi “sembra” essere 45. Nelle cellule-uovo mature può mancare completamente il cromosoma 21 e di conseguenza nel prodotto del concepimento vi è un solo cromosoma 21, quello paterno, (monosomia 21), situazione incompatibile con il proseguimento della gravidanza, ammesso che si instauri una gravidanza. In alternativa nell’uovo possono essere presenti i due cromosomi 21 fusi: pertanto si instaurerà fatalmente la trisomia per traslocazione. Fig. 2. La presenza di una traslocazione bilanciata coinvolgente un cromosoma 21 ( non la traslocazione 21-21) in un genitore comporta ovviamente un rischio quantificabile per ciascun concepito, rischio di “sbilancio” del quale si dovrà dare informazione agli interessati. Esiste, raramente, una situazione paradossale nella quale il numero dei cromosomi risulta normale. In questi casi non sussiste la trisomia completa del cromosoma 21, ma di una parte di esso, indicata come “regione critica” inserita in uno dei cromosomi. Evidentemente questa situazione è estremamente preoccupante per il rischio di porre una diagnosi prenatale errata. c) mosaico: tale condizione prevede la presenza di linee cellulari normali e di linee cellulari con trisomia (libera o da traslocazione) e con diverse percentuali delle due linee. Si può pensare che questa situazione derivi da una mutazione somatica avvenuta in alcune cellule fetali durante le prime fasi dello sviluppo embrionale. La corrispondente sintomatologia clinica è variabile, con note sfumate della SD. Cariotipo maschile con trisomia del cromosoma 21. Fig. 1 Cariotipo maschile con trisomia del cromosoma 21 e traslocazione 21-21. Fig. 2 LA CONSULENZA GENETICA PER LA SINDROME DI DOWN Il quesito sostanziale che viene posto al consulente genetista, a parte le caratterizzazioni individuali, è il seguente: il figlio che eventualmente concepirò o che ho già concepito quale probabilità ha di essere affetto dalla SD? Se si fa riferimento ad una gravidanza futura ed eventuale si può rispondere come segue: a) se sono presenti casi in famiglia si deve escludere, mediante esame del cariotipo, che uno dei due genitori sia portatore di traslocazione bilanciata. Se non esiste ricorrenza familiare, è molto raro (circa 4% dei casi) che sussista in uno dei due futuri genitori la condizione di traslocazione bilanciata: si tenga presente che la traslocazione bilanciata non dà nessun segno di sé nell’aspetto fisico. Pertanto l’esecuzione del cariotipo viene decisa in base a particolari condizioni psicologiche della coppia, spiegando dettagliatamente che l’accertamento dell’assenza di traslocazione non esclude il rischio della trisomia libera, rischio legato, come si è visto, ad una non disgiunzione della coppia 21 al momento del concepimento. b) se non esistono casi familiari e se si accerta che i due genitori non hanno la traslocazione bilanciata, il rischio di concepire un feto con SD dipende, per quanto si sa, solo dall’età della madre. c) se l’accertamento diagnostico viene effettuato in periodo prenatale si esegue il cariotipo del feto su cellule del liquido amniotico prelevate mediante amniocentesi o su cellule dei villi coriali prelevate mediante villocentesi o, molto più raramente, su cellule del sangue fetale ottenuto per cordocentesi. In base alla esperienza personale, la diagnosi prenatale viene richiesta per: a) età della madre nella maggior parte dei casi considerata a rischio. Allo stato attuale si considera rischio sufficiente per eseguire la diagnosi prenatale con spesa a carico del Sistema Sanitario Nazionale quello corrispondente ai 35 anni di età al parto e oltre. b) ad età inferiori di 35 anni per evitare stress psicologici della donna, magari condizionata dalla presenza di casi di SD in famiglia, c) in caso di pregressa gravidanza con feto affetto, d) la ricorrenza di più casi di SD nella famiglia. La consulenza genetica per la SD, ed in generale per tutte le malattie geneticamente determinate, non è suscettibile di un’esposizione schematica: è una prestazione professionale assolutamente individuale nella quale si debbono prendere in considerazione, oltre ai dati obiettivi, caratteristiche psicologiche specifiche degli utenti; deve essere un vero e proprio “counseling” ovvero una operazione di informazione e di aiuto. Si deve tenere presente che attualmente i genitori che si presentano alla consulenza genetica hanno spesso conoscenza diretta di bambini con la SD, a volte e per quanto possibile, favorevole, a volte esageratamente negativa. Inoltre, l’ambiente familiare condiziona ulteriormente le persone coinvolte nel problema. Una diagnosi prenatale dimostrativa della presenza della SD nel prodotto del concepimento mette i genitori di fronte a decisioni cruciali e conflittuali, gravate da fattori personali psicologicamente incisivi. Una diagnosi eseguita alla nascita pone i genitori di fronte ad una realtà drammatica ed inattesa che deve essere accettata e che fatalmente scatenerà una articolata richiesta di informazioni. Una particolare attenzione deve essere riservata alla collaborazione con lo psicologo che sicuramente ha un valore determinante nel supporto della famiglia. Un psicologo con esperienza mirata nel campo nella SD può fornire un contributo essenziale e personalizzato di supporto alle conoscenze scientifiche. Lo psicologo può cogliere aspetti particolari del disagio derivante dalla presenza in famiglia di una persona Down e di conseguenza, dall’elaborazione di queste informazioni possono essere delineati interventi di ordine generale o peculiare. IL CROMOSOMA 21 Il cromosoma 21 è il più piccolo cromosoma umano: le due copie del cromosoma, che ogni individuo presenta, costituiscono circa lo 1,5% del DNA totale della cellula (1). I dati inerenti l’anatomia di questo cromosoma risultano moderatamente differenti a seconda dei metodi di analisi del DNA utilizzati (2). Le variabili riscontrate possono essere: • Numero di geni (sequenze di DNA che determinano specifiche sequenze di proteine) secondo i diversi database: 212 - 261 - 284 - 274 - 364. • Lunghezza fisica del cromosoma 21: 33,5 megabasi per il braccio lungo; 5-15 megabasi per il braccio corto. • Distanza genetica: 61,7 - 67,3 centiMorgan. Numerose ricerche scientifiche si sono indirizzate a costruire un atlante (catalogo o mappa di espressione) dei geni del cromosoma 21 avvalendosi della corrispondenza tra numerosi geni del cromosoma 21 umano e quelli ortologhi del topo presenti sui cromosomi 16, 17 e 10 dell’animale (3). il presupposto tecnico di questi studi si basa sulla valutazione dell’espressione genica in diversi stadi dello sviluppo embrionale nel topo; in questo modo è stato possibile “distri buire” l’attività biologica dei geni nei tessuti e/o organi che si sviluppano nei diversi stadi embrionali. Un’altra linea di ricerca prevede l’identificazione di sequenze nucleotidiche che non codificano per alcuna proteina; tali sequenze, denominate CNG (Conserved Non-Genic), si trovano nella regione del cromosoma 21 dove sono presenti pochi geni (2) e sono straordinariamente conservate fra topo e uomo. Nella trisomia 21 tutti i geni che vi sono localizzati sono presenti in triplice copia (3): tre sono le possibili conseguenze di tale squilibrio genico: 1) effetti primari: aumento dell’espressione dei geni del cromosoma trisomico proprio perché presenti in sovrappiù: il rapporto di espressione fra un gene in triplice copia ed un gene “normale” dovrebbe essere di 1,5 : 1; in altri termini per ogni prodotto genico “normale” è presente una proteina e mezza del gene triplice; 2) effetti secondari: alterazione della espressione di altri geni localizzati su altri cromosomi sempre come conseguenza mediata della triplice presenza di ciascun gene del cromosoma 21; 3) effetti terziari: alterazione di altri geni riferibile a fenotipi cellulari/biochimici a loro volta dovuti alla condizione trisomica. Gli effetti primari sono stati ritenuti i più verosimili e logici: il metodo di verifica ha analizzato i livelli di RNA-messaggero di geni ortologhi del topo. Ebbene solo il 37% dei 78 geni sul cromosoma 16 dell’animale, analoghi a quelli del cromosoma 21 umano, è risultato sovrae-spresso secondo la proporzione attesa di 1,5 volte quella normale; infatti, la sovraespressione genica era presente in proporzione minore in 45 geni e maggiore di 1,5 in 18 geni. Tale fenomeno riscontrato potrebbe essere interpretato nel senso che solo pochi geni sono responsabili del quadro clinico della SD: in parole semplici, pochi geni del cromosoma 21 interferiscono su altri geni localizzati su altri cromosomi condizionandone la attività di sintesi proteica: la stessa interferenza potrebbe verificarsi da parte di prodotti genici (proteine) sempre riferibili al cromosoma 21. Questo fenomeno complesso va sotto il nome di “transregolazione”. Si può proporre a titolo di esempio il gene SOD1, presente sul cromosoma 21, la cui espressione fenotipica è l’enzima Cu-Zn-Superossidodismutasi (4).Tale gene SOD1 si trova sul cromosoma 21 ed è, dunque, presente in triplice dose nelle persone Down con un’attività che è il 150% del normale. La Cu-Zn-Superossidodismutasi consente la trasformazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) in H O (acqua ossigenata), di per sé instabile perché libera ossigeno monoatomico. 1 2 2 Le ROS (1) hanno una vita brevissima perché scaricano l’alta energia di cui sono dotate su strutture molecolari o cellulari (6). Alcune conseguenze di questo fenomeno sono l’ossidazione del triptofano, il deficit di sintesi di serina e di 5-HiAA, la lipoperossidazione di membrana, la nitrazione delle proteine, la produzione de desossi-guanosina e i danni nella struttura del DNA e dei cromosomi. Tali processi sono implicati nell’invecchiamento cellulare. Per il mantenimento delle ROS a livelli normali devono avvenire delle reazioni di bilanciamento catalizzate da due enzimi, la catalasi e la glutationeperossidasi, che si trovano in cromosomi diversi dal 21. Da tali reazioni si eliminano le ROS ottenendo acqua “normale” (7). in sostanza, nella sD il rapporto: SUPEROSSIDODISMUTASI / CATALASI + GLUTATIONE PEROSSIDASI è superiore a 1 (8). La conseguenza ultima è che si generano ROS in eccesso rispetto alle possibilità di smaltimento. L’accumulo di ROS produce i fenomeni sopraelencati che clinicamente simulano il quadro psicologico e fisico della senescenza, fenomeno anticipato nelle persone Down (9). Alcuni geni presenti sul cromosoma 21 e, di conseguenza, espressi in modo anomalo nei Down, sono: nel braccio lungo del cromosoma 21 • gene per la sintesi del precursore della sostanza amiloide (quella correlata con la sindrome di Alzheimer), • oncogene per la leucemia mieloide acuta, • geni per la sintesi dei nucleotidi adenosina e guanosina (riparazione del DNA) dei danni che potrebbero essere provocati proprio dai radicali liberi. nella regione critica • gene per la funzionalità tiroidea • gene per il metabolismo della serina • geni per la sintesi del collagene • geni correlabili con la miopia • gene per il metabolismo dell’acido folico. A tali geni sopra elencati sembra molto plausibile attribuire un ruolo “eziologico” nelle corrispondenti patologie che caratterizzano la SD, non è, però, ancora risolto il problema di individuare il meccanismo che porta dalla condizione trisomica al fenotipo Down (10). In sostanza si dibattono in letteratura due ipotesi o teorie: 1) le manifestazioni fenotipiche sono tutte riconducibili alla triplice dose dei geni del cromosoma 21. I geni sopra elencati confermerebbero questa ipotesi, anche se per altri sintomi non è ancora stato individuato il gene o i geni responsabili. 2) la correlazione genotipo-fenotipo sarebbe meno univoca, nel senso che la condizione trisomica determinerebbe un’instabilità genomica generale con le conseguenze ben note. Alcune osservazioni sui topi sembrerebbero avvalorare questa seconda ipotesi (11). Si può fondatamente prevedere che in futuro con il proseguire delle conoscenze scientifiche si otterranno risultati ancora più significativi e completi. Le ROS (o RomS) sono atomi o molecole assolutamente instabili perché hanno un elettrone spaiato nell’orbita più esterna e si generano in tutte le reazioni biochimiche cui partecipa l’ossigeno (5). 1 Esse sono: ossigeno monoatomico • ione superossido • ione idroperossido • ossigeno singoletto BIBLIOGRAFIA 1. Hattori M., Fujiama A., Taylor T. et Al, The DNA sequence of Human chromosome 21. Nature, 2000, 405: 311-319. 2. Reymond A., Human chromosome 21 gene expression atlas in the Mouse. Nature, 2002, 420: 582-586. 3. Rachidi M., Lopes C., Mental retardation and associated neurological Dysfunction in Down syndrome: a consequence of disregulation in critical chromosome 21 genes and associated mole-cularpathways. Eur J Paediatr Neurol, 2007,12. 4. Druzhyna N., Nair R., Ledoux S., Wilson G., Defective repair of oxidative damage in mito-chondrial DNA in Down’s syndrome, Mutat.Res., 1998, 409: 81-89. 5. Hayn M., Kremser K., Singewald N., et Al: Evidence against the involvement of reactive oxygen species in the pathogenesis of neuronal death in Down Alzheimer’s diseasae, Life Sci, 1996, 59: 537-44. 6. Komatsu T., Lee Mc., Miyagi A., et Al, Reactive oxygen species generation in gingival fibro-blasts of Down syndrome patients detectedby electron spectroscopy, Redox Rep, 2006,11(2): 71-77. 7. Chandan Ks., Sies H., Baeuerle P.A., Antioxidant and Redox Regulation of Genes, Academic Press. 2001. 8. Antonarakis S.E., Lyle R., Reymond A., Deuttsch S., Chromosome 21 and Down syndrome: from genomics to pathophysiology, Nat Rev Genet, 2004, 5: 725-738. 9. Gualandri V., Gualandri L., Fraschini F., et Al, Redox balance in Patients with Down’ syndrome before and after dietary supplementation with alfa-lipoic acid and l-cysteine, Int J Clin Pharmacol Res, 2003, 23: 23-30. 10. Olson L.E., Richtsmeier J.T., Leszl J., Leves R.H., A chromosome 21 critical region does not cause specific Down syndrome phenotypes, Science, 2004, 306: 687-690. 11. Lockstone H.E., Harris L.W., Swatton J.E., et Al, Gene expression in the adult Down syndrome brain, Genomics, 2007,15: 13-17.